espectrofotometria.

ESPECTROFOTOMETRIA.

Muchas técnicas analíticas que se emplean en laboratorios de química clínica incorporan los principios de instrumentación espectrofotométrica. La espectrofotometría se utilizan los patrones característicos de absorbancia  de radiación electromagnética para identificar los analitos de interés. Cuando se conoce el patrón espectral se usa la longitud de onda luminosa la cual la absorbancia es máxima, cuantificar dicha sustancia en solución.

Características de la luz.

Debido que la espectrofotometría comprende mediciones con detectores de la radiación electromagnética que se trasmite, es fundamental conocer las principales características de la radiación electromagnética, la luz es una forma visible de radiación electromagnética; o sea que se comporta como si tuviera campos eléctricos y magnéticos oscilados en planos perpendiculares entre si.

Características de la longitud de onda.

La luz, como toda radiación electromagnética, está formada de fotones o paquetes de energía (E) que viajan en ondas. El espectro electromagnético se describe en términos de longitud de onda.

La longitud de onda del espectro electromagnético es la distancia entre los máximos de ondas sucesoras. En el sistema internacional se mide en nanómetros (nm), el número de ondas por el segundo se denomina frecuencia. La longitud de onda se relaciona inmensamente con la energía, mientras mayor es la longitud de onda es menor el número de fotones que contiene. En otras palabras la longitud de onda larga es de baja energía, de manera similar la longitud de onda corta posee más energía.

Espectro electromagnético.

Es el rango de todas las radiaciones electromagnéticas posibles. El espectro de un objeto es la distribución característica de la radiación electromagnética de ese objeto.

El espectro electromagnético se extiende desde las bajas frecuencias usadas para la radio moderna (extremo de la onda larga) hasta los rayos gamma (extremo de la onda corta), que cubren longitudes de onda de entre miles de kilómetros y la fracción del tamaño de un átomo. Se piensa que el límite de la longitud de onda corta está en las cercanías de la longitud Planck, mientras que el límite de la longitud de onda larga es el tamaño del universo mismo, aunque en principio el espectro sea infinito y continuo.

Espectro ultravioleta.

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 380nm. Posee una región de energía muy alta, provoca daños al ojo humano, la región UV es importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos.

Espectro visible.

Se describe como el rango de longitudes de ondas visibles a simple vista. Esta región va de 380 a 700 nm, se obtiene un espectro continuo con un color visible distinto que corresponde a determinada porción de longitud de onda.

El color visible de una solución corresponde a la longitud de onda que trasmite, no que se absorbe, el color que se absorbe es el complementario del color que se trasmite, por tanto, para efectuar mediciones de absorción es necesario utilizar longitud de onda a la cual la solución colorida absorbe luz.
 

Radiación infrarroja.

Se emplea sobre todo en análisis toxicológicos.

 Ley de Beer.

La mayoría de las medidas espectrofotométricas se basan en la ley de Beer, la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida, e inversamente proporcional al logaritmo de la luz trasmitida y se expresa matemáticamente así.

A = a.b.c. = 2 – log % T donde:

A = absorbancia.

a = absortividad o coeficiente de absorción.

b = longitud de paso de la luz en centímetros.

c = concentración de la sustancia en interés.

%T = porcentaje de transmitancia.

Absorbancia.

Este compuesto es sinónimo de densidad óptica, se define como la cantidad de energía radiante que una sustancia absorbe a determinada longitud de onda.

Transmitancia.

Es la cantidad de energía radiante que trasmite o deja pasar una sustancia a una determinada longitud de onda.

Espectrofotometría:

Es la medición de la intensidad de la energía radiante en estrecho intervalo de longitud de onda del espectro. Para la selección de la longitud de onda se utilizan rejillas de difracción o prisma.

Fotometría

Es el procedimiento por el cual se efectúan mediciones de energía radiante utilizando filtro para aislar parte del espectro.

Pruebas colorimétricas.

Blanco reactivo

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Casi todos los reactivos poseen una coloración que tendrán una absorbancia que tienen que ver con el color original que este trae, por lo tanto necesitamos eliminarla para no aumentar la absorbancia de la muestra. Así que sirve para eliminar la absorbancia propia del reactivo, esta resta puede realizarse de manera manual o automáticamente con el fotocolorímetro o espectrofotómetro.

Blanco de muestra.

Es un tubo que se monta utilizando agua destilada y se usa para eliminar la absorbancia propia de la muestra en los casos que se esta presente, hemolisis, ictericia o lipemia.

Blanco de aire.

Es realizarle un cero de absorbancia al equipo para eliminar cualquier inferencia.

Estándar.

Es una solución patrón que tiene una concentración conocida de un determinado metabolito y se utiliza para comparar su color con el de la muestra, y lo más importante, para calcular la concentración del metabolito en estudio en la muestra examinada, a través de la siguiente formula en la ley de Beer.

Concentración        = absorbancia de la muestra          

De la muestra            …………………………………..     X  la concen del estándar.

                                     Absorbancia del estándar.