ELISA.

ELISA.

El examen de ELISA es una de las pruebas más eficaces para detectar el virus del VIH.

Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en  la muestra.

Que es un inmunoensayo.

Inmunoensayo es un conjunto de técnicas inmunoquimicas analíticas de laboratorio que tienen en común usar complejos inmunes, es decir los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito determinado, que puede ser el anticuerpo (Ac) o un antígeno (Ag), usado para la medición una molécula como marcador que hace parte de la reacción con el complejo inmune en la prueba o ensayo químico.

Los inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas de laboratorios (como las colorimétricas) ya que usan complejos Ac-Ag para generar una señal que pueda medirse.

Antígeno (Ag).

Molécula exógena, que se encuentra en la superficie de un agente patógeno, y que al entrar en contacto con el organismo, induce la producción de una respuesta del sistema inmune especifica (formación de Acs).

Anticuerpo (Ac).

Proteína producida como respuesta a una sustancia extraña (Ag) y tiene la capacidad de combinarse con el (complejo Ag-Ac).

Tipos de Elisa.

ELISA no competitivo.

Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formara el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado reaccionara con el respectivo sustrato desarrollando color.

-       Directo detectan Ag.

-       Indirecto detectan Ac.

-       Elisa de sándwich.

ELISA competitivo.

El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrara a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el Ac presente en la muestra.

Pasos generales.

1.    Tapizado de pocillo con el Ag – Ac.

2.    Adición de la muestra problema con la muestra Ags . Acs.

3.    Unión del Ag – Ac especifico al Ag o Ac tamizado en el pocillo.

4.    Lavado del pocillo para eliminar el exceso del Ag o Ac no unido.

5.    Adición del Ac secundario marcado por la enzima.

6.    Unión del Ac secundario al Ag o Ac.

7.    Lavado del pocillo para eliminar el exceso enzima no unida.

8.    Adición del sustrato.

9.    Unión del sustrato a la enzima.

10.  Coloración.

   ELISA DIRECTO.

   

   ELISA INDIRECTO.

  

   En este video nos explican en que consiste la prueba de ELISA.

                            

nefelometria

Nefelometría.

Se basa en la detección de los complejos Ag-Ab, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos laser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y a la cantidad de complejos formados. 

La nefelometría es un procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente  en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier angulo.

La intensidad depende de: el número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersarte, y la longitud de onda de la radiación dispersada. La relación entre variables y es más factible un tratamiento teórico, pero debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analíticos específicos.

Procedimiento analítico

Se basa en la dispersión  de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier angulo.

La intensidad depende del número de partículas sus pendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. Cuando la concentración de una suspensión de partícula es baja es preferible medirla por este método.

Nefelómetro

Un nefelómetro es un instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido. Esto lo hace empleando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente luminosa. La densidad de partículas es entonces una función de la luz reflejada por las partículas a la fotocelda. Cuanta más luz se refleje en una determinada densidad de partículas depende delas propiedades de las partículas como su forma, color y reflectividad. Estableciendo a una correlación de trabajo entre turbidez y solidos suspendidos  (que más útil, pero generalmente una más difícil de cuantificación de partículas) debe ser establecido independientemente para cada situación. 

Turbidimetria.

Turbidimetria.

La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ejemplo:

Determinación de proteínas totales en suero o en  orina (haciendo que las proteínas precipiten con ácido sulfosalicílico).

Turbidimetría fundamento.

La turbidimetría puede realizarse en espectrofotómetros de visible o violeta. Cuando la concentración de partículas en suspensión se mide por turbidimetría, la suspensión se pone en una cubeta similar a un tubo de ensayo, que permite realizar las medidas de las energía incidentes y transmitidas. La fuente de radiación más frecuentemente usadas es la lámpara dewolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiación visible. Si ponemos en la cubeta suspensiones coloreadas se debe usar un filtro para evitar que influya sobre los resultadosdando valores excesivamente altos.  Los Turbidímetros pueden incorporar cualquier detectorque sea sensible a la longitud de onda transmitida.

La turbidimetría tiene una gran variedad de aplicaciones y permite trabajar con muestras gaseosas, liquidas e incluso con sólidos transparentes. La formación deprecipitados difíciles de filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamaño de partícula muy pequeño, suelen proporciona suspensiones ideales para la aplicación de técnicas basadasen la dispersión de la luz que sustituye a las técnicas gravimétricas. Este tipo de aplicaciones son frecuentes en laboratorios analíticos, laboratorios clínicos y en plantas de procesos. Uno de los principales campos de aplicación reside en estudios de polución de aire y agua, donde las dos técnicas se usan para determinar la transparencia y controlar el tratamiento de aguas potables, e fluentes de plantas de tratamiento de aguas y otros tipos de aguas ambientales.

Las medidas de dispersión de la luz se utilizan también para determinar la concentración de humos, polvo, niebla, aerosoles, etc. A pesar de que los términos turbidimetría y nefelometría suelen restringirse a aquellas aplicaciones en las que se mide la concentración de partículas en suspensión existen también otros tipos de aplicaciones basados en las medidas de dispersión de la luz. Entre ellas podemos citar la determinación de la forma y tamaño de las partículas así como la de los pesos, moleculares (especialmente en el caso de polímeros).

¿Cómo diferenciar la turbidimetría y la nefelometría?

Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La turbidez es la propiedad óptica de una muestra que hace que la radiación sea dispersada y absorbida más que transmitida en línea recta a través de la muestra. La turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un líquido.

Hay dos métodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetría y la nefelometría. Son dos técnicas complementarias que seutilizan para el análisis cuantitativo de disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas.

La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección dela propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. En la turbidimetría se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega ala disolución. En cambio, en la nefelometría la medida de la intensidad de luz se hace con un ángulo de 90º con respecto a la radiación incidente. El instrumento usado en la nefelometría, el nefelómetro se asemeja al fluorómetro. En cambio en turbidimetría se utiliza el turbidíemetro que es un fotómetro de filtro.

Electroforesis.

Electroforesis.

 La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

También es una técnica para la separación de moléculas que se basa en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional, la ventaja de la electroforesis es la separación, visualización y cuantificación del número de proteínas de una solución, pero esta también afecta la estructura de las proteínas por lo tanto, afecta a la función de la misma.

Métodos electroforéticos zonales.

Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los  soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos  de convección del solvente. 

 Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros.  Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la  longitud del trayecto es mucho mayor  que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder,  cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos.

Electroforesis en gel  de poliacrilamida.

 Los geles de poliacrilamida se forman por  polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

Electroforesis en geles de agarosa.

 La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.

Factores que afectan la electroforesis.

-       Carga neta.

-       Tamaño.

-       Intensidad del campo eléctrico.

-       Temperatura.

-       Medio soporte.

-       Buffer.

Cromatografia.

CROMATOGRAFIA.

La cromatografía es uno de los principales métodos para la separación de especies química estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.

En todos separaciones cromatograficas la muestra se disuelve en una fase móvil que puede ser un gas un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una superficie sólida. Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

-       Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlo más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final muchas síntesis).

-       Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

Clasificación de los métodos de separación de cromatografía.

Las distintas técnicas cromatograficas se pueden dividir según como esté dispuesta la fase estacionaria:

-       Cromatografía plana, la fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana p sobre un papel.  Las principales técnicas son:

-       Cromatografía en papel.

-       Cromatografía en capa fina.

Cromatografía en columna, la fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:

-       Cromatografía de líquidos.

         Cromatografía de gases

-       Cromatografía de fluidos supercríticos.

a   aquí podemos observar un pequeño video de cromatografia.

espectrofotometria.

ESPECTROFOTOMETRIA.

Muchas técnicas analíticas que se emplean en laboratorios de química clínica incorporan los principios de instrumentación espectrofotométrica. La espectrofotometría se utilizan los patrones característicos de absorbancia  de radiación electromagnética para identificar los analitos de interés. Cuando se conoce el patrón espectral se usa la longitud de onda luminosa la cual la absorbancia es máxima, cuantificar dicha sustancia en solución.

Características de la luz.

Debido que la espectrofotometría comprende mediciones con detectores de la radiación electromagnética que se trasmite, es fundamental conocer las principales características de la radiación electromagnética, la luz es una forma visible de radiación electromagnética; o sea que se comporta como si tuviera campos eléctricos y magnéticos oscilados en planos perpendiculares entre si.

Características de la longitud de onda.

La luz, como toda radiación electromagnética, está formada de fotones o paquetes de energía (E) que viajan en ondas. El espectro electromagnético se describe en términos de longitud de onda.

La longitud de onda del espectro electromagnético es la distancia entre los máximos de ondas sucesoras. En el sistema internacional se mide en nanómetros (nm), el número de ondas por el segundo se denomina frecuencia. La longitud de onda se relaciona inmensamente con la energía, mientras mayor es la longitud de onda es menor el número de fotones que contiene. En otras palabras la longitud de onda larga es de baja energía, de manera similar la longitud de onda corta posee más energía.

Espectro electromagnético.

Es el rango de todas las radiaciones electromagnéticas posibles. El espectro de un objeto es la distribución característica de la radiación electromagnética de ese objeto.

El espectro electromagnético se extiende desde las bajas frecuencias usadas para la radio moderna (extremo de la onda larga) hasta los rayos gamma (extremo de la onda corta), que cubren longitudes de onda de entre miles de kilómetros y la fracción del tamaño de un átomo. Se piensa que el límite de la longitud de onda corta está en las cercanías de la longitud Planck, mientras que el límite de la longitud de onda larga es el tamaño del universo mismo, aunque en principio el espectro sea infinito y continuo.

Espectro ultravioleta.

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 380nm. Posee una región de energía muy alta, provoca daños al ojo humano, la región UV es importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos.

Espectro visible.

Se describe como el rango de longitudes de ondas visibles a simple vista. Esta región va de 380 a 700 nm, se obtiene un espectro continuo con un color visible distinto que corresponde a determinada porción de longitud de onda.

El color visible de una solución corresponde a la longitud de onda que trasmite, no que se absorbe, el color que se absorbe es el complementario del color que se trasmite, por tanto, para efectuar mediciones de absorción es necesario utilizar longitud de onda a la cual la solución colorida absorbe luz.
 

Radiación infrarroja.

Se emplea sobre todo en análisis toxicológicos.

 Ley de Beer.

La mayoría de las medidas espectrofotométricas se basan en la ley de Beer, la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida, e inversamente proporcional al logaritmo de la luz trasmitida y se expresa matemáticamente así.

A = a.b.c. = 2 – log % T donde:

A = absorbancia.

a = absortividad o coeficiente de absorción.

b = longitud de paso de la luz en centímetros.

c = concentración de la sustancia en interés.

%T = porcentaje de transmitancia.

Absorbancia.

Este compuesto es sinónimo de densidad óptica, se define como la cantidad de energía radiante que una sustancia absorbe a determinada longitud de onda.

Transmitancia.

Es la cantidad de energía radiante que trasmite o deja pasar una sustancia a una determinada longitud de onda.

Espectrofotometría:

Es la medición de la intensidad de la energía radiante en estrecho intervalo de longitud de onda del espectro. Para la selección de la longitud de onda se utilizan rejillas de difracción o prisma.

Fotometría

Es el procedimiento por el cual se efectúan mediciones de energía radiante utilizando filtro para aislar parte del espectro.

Pruebas colorimétricas.

Blanco reactivo

.

Casi todos los reactivos poseen una coloración que tendrán una absorbancia que tienen que ver con el color original que este trae, por lo tanto necesitamos eliminarla para no aumentar la absorbancia de la muestra. Así que sirve para eliminar la absorbancia propia del reactivo, esta resta puede realizarse de manera manual o automáticamente con el fotocolorímetro o espectrofotómetro.

Blanco de muestra.

Es un tubo que se monta utilizando agua destilada y se usa para eliminar la absorbancia propia de la muestra en los casos que se esta presente, hemolisis, ictericia o lipemia.

Blanco de aire.

Es realizarle un cero de absorbancia al equipo para eliminar cualquier inferencia.

Estándar.

Es una solución patrón que tiene una concentración conocida de un determinado metabolito y se utiliza para comparar su color con el de la muestra, y lo más importante, para calcular la concentración del metabolito en estudio en la muestra examinada, a través de la siguiente formula en la ley de Beer.

Concentración        = absorbancia de la muestra          

De la muestra            …………………………………..     X  la concen del estándar.

                                     Absorbancia del estándar.